যে এনজাইম প্রয়োগ করে DNA অণুর সুনির্দিষ্ট সিকুয়েন্স-এর একটি অংশ কেটে নেয়া যায় ঐ এনজাইমকে রেস্ট্রিকশন এনজাইম বলে। এদেরকে রেস্ট্রিকশন এন্ডোনিউক্লিয়েসেস (\end{onucleases})ও বলা হয়। এরা DNA অণুর একটি সুনির্দিষ্ট সিকুয়েন্স, যাকে রেস্ট্রিকশন সাইট (restriction site বা Recognition site) বলা হয়, তা কেটে দিতে সক্ষম। এ ধরনের এনজাইম প্রাকৃতিকভাবেই ব্যাকটেরিয়া কোষে বিদ্যমান থাকে। এদের কাজ হলো ব্যাকটেরিয়াকে আক্রমণকারী ভাইরাল DNA কেটে দেয়া। স্বাভাবিকভাবে এরা ভাইরাল DNA কেটে থাকে, তবে যে কোনো উৎস থেকে পাওয়া যে কোনো DNA সূত্রের নিউক্লিয়োটাইডের ঐ একই সিকুয়েন্স (রেস্ট্রিকশন সাইট) সমান দক্ষতার সাথে কাটতে সক্ষম। প্রতিটি ব্যাকটেরিয়াম কোষ কমপক্ষে একটি রেস্ট্রিকশন এনজাইম উৎপন্ন করে থাকে। শত শত প্রকার ব্যাকটেরিয়া কোষে শত শত ধরনের রেস্ট্রিকশন এনজাইম উৎপন্ন হয়। এরা DNA সূত্র কাটার জন্য নিজস্ব সিকুয়েন্স শনাক্ত করতে পারে এবং ঐ রেস্ট্রিকশন সাইট কেটে দিতে পারে।